亮點或者創新之處

本文將CRISPR-Cas12a系統與MRS傳感相結合，構建基于CRISPR-Cas12a系統的MRS生物傳感器檢測沙門氏菌。充分利用MNPs作為磁分離工具和信號標簽的雙重功能，為生物傳感器的設計提供了新思路。同時，得益于CRISPR-Cas12a系統的高特異性和MRS檢測的高靈敏度，該生物傳感器對沙門氏菌具有良好的檢測性能。

核心結論

構建基于CRISPR-Cas12a的MRS生物傳感器檢測沙門氏菌。引入小粒徑的MNPs作為磁信號探針，開發MNPs產生信號的新功能。該生物傳感器通過CRISPR-Cas12a系統在目標物存在下對biotin-S₁的切割作用控制兩種不同粒徑MNPs的結合，然后利用大小粒徑MNPs磁分離速度的差異，以溶液中游離的小粒徑MNPs為信號輸出分子檢測沙門氏菌。得益于CRISPR-Cas12a系統的高特異性和高效切割活性以及MRS檢測方法的高靈敏度，該生物傳感器對純菌液和雞肉提取液加標樣品中沙門氏菌的LOD分別為1.3×10² CFU mL^-1和1.8×10³ CFU mL^-1，且可避免重復磁分離與洗滌，操作更為簡便。

研究背景

MNPs可作為MRS傳感檢測中的磁性探針。傳統的基于MNPs聚集/分散狀態改變的MRS生物傳感方法易受樣品基質干擾，穩定性較差。基于MNPs數量變化的MRS生物傳感器已經得到了較好的發展。但是以上方法需要目標物自身提供位點以控制大小粒徑MNPs之間的結合。目標物的表面位點有限且可能發生非特異性結合，因而檢測靈敏度會受到影響。為此，本文將CRISPR-Cas12a系統與MRS傳感技術相結合，利用CRISPR-Cas12a系統精準控制兩種不同粒徑MNPs之間的結合，開發基于CRISPR-Cas12a的MRS生物傳感器檢測沙門氏菌。

實驗方案或者實驗材料

如圖1所示，分別在粒徑為130 nm和30 nm左右的MNP130和MNP30表面修飾SA和S2，制得SA修飾的MNP130（MNP130-SA）和S2修飾的MNP30（MNP30-S2）探針。當目標物存在時，Cas12a、crRNA和靶標DNA形成三元復合體，并激活trans切割活性以非特異性切割biotin-S1。因此，MNP30-S2無法通過S1和S2之間的堿基互補配對作用結合至MNP130-SA表面，在磁場作用下仍分散在溶液中。反之，大量MNP30-S2結合至MNP130-SA表面，并在磁場作用下被分離。最后，以清液中游離的MNP30-S2為探針，通過橫向弛豫時間T2的測定檢測沙門氏菌。

圖1

紐邁核磁助力：利用低場核磁設備（PQ001，紐邁電子科技有限公司，上海，中國）測量獲得樣品的橫向弛豫時間T₂。在測定T₂時，儀器的溫度精確設置為32±0.01°C。利用硬脈沖序列Q-FID校準儀器中心頻率O1及尋找90^o射頻脈寬P1和180^o脈寬P2。然后，利用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脈沖序列進行T₂的測量。

結果分析

1：利用TEM表征MNP₁₃₀-SA在有無目標物存在下的表面狀態。如圖2A所示，MNP₁₃₀-SA的粒徑為130 nm左右；而MNP₃₀-S₂的粒徑在30 nm左右。在無目標物存在下，MNP₁₃₀-SA捕獲biotin-S₁，并與MNP₃₀-S₂結合，因此MNP₁₃₀-SA表面結合了大量MNP₃₀-S₂。而當目標物存在下，Cas12a/crRNA復合體的trans切割活性被激活，使biotin-S₁被非特異性切割，從而影響MNP₁₃₀-SA與MNP₃₀-S₂之間的結合。因此MNP₁₃₀-SA周圍僅有極少量MNP₃₀-S₂的存在。以上TEM表征結果證明了該生物傳感器檢測S. Typhimurium具備可行性。

圖 2

2：考察切割方式對檢測效果的影響。即方案1：先將biotin-S₁偶聯至MNP₁₃₀-SA表面制得MNP₁₃₀-S₁，然后利用CRISPR-Cas12a系統切割MNP₁₃₀表面的S₁；方案2：切割溶液中游離的biotin-S₁，然后加入MNP₁₃₀-SA進行捕獲。采用方案1時，利用肉眼觀察分散性變化即可實現目標物的定性檢測，簡單方便，但是靈敏度較低；而采取方案2則可顯著提高MRS生物傳感器對目標物的響應。為提高檢測靈敏度，在后續實驗中繼續采取方案2的切割方式檢測沙門氏菌。

圖 3

3：從圖4可以看出，1.3×10² CFU mL^-1細菌濃度下的T₂值已低于閾值線，說明該方法可對1.3×10² CFU mL^-1的S. Typhimurium進行檢測，其LOD明顯低于大部分已報道的MRS生物傳感器。對雞肉提取液加標樣品中的S. Typhimurium進行檢測。該方法對雞肉提取液中S. Typhimurium的LOD為1.8×10³ CFU mL^-1。將純菌液和雞肉提取液中的檢測結果進行對比發現，雞肉提取液中10³ CFU mL^-1細菌引起的信號響應明顯高于純菌液（ΔT₂%分別為10%和47%）。為評估該生物傳感器對沙門氏菌的特異性，選取S. aureus、E. coli O157:H7、V. parahaemolyticus和L. monocytogenes四種常見食源性致病菌作為考察對象。S. Typhimurium和四種非目標菌的濃度均為10⁵ CFU mL^-1。如圖所示，相較于空白對照，非目標菌引起的信號變化率均在5%以內，而目標物S. Typhimurium則可引起60%以上的信號下降，體現了該生物傳感器良好的特異性。

圖 4

結論

本文提出了一種基于CRISPR-Cas12a系統的MRS生物傳感器檢測沙門氏菌。該方法利用CRISPR-Cas12a系統控制兩種不同粒徑MNPs的結合，并以游離的小粒徑MNPs為磁性探針實現MRS信號輸出，對純菌液和雞肉提取液加標樣品中S. Typhimurium的LOD分別為1.3×10² CFU mL^-1和1.8×10³ CFU mL^-1。該方法充分利用了MNPs作為磁分離載體和信號標簽的雙重功能。此外，檢測磁分離后的清液省去了繁瑣的重復洗滌操作，簡化了檢測步驟。通過設計特定的crRNA，該方法亦可拓展至其他目標物的檢測，具備一定的通用性。

該研究工作得到了國家自然科學青年基金，沃爾瑪基金會和沃爾瑪食品安全協作中心的的資助與支持。